“DNA量不够怎么破?扩增来凑!”

  • A+
所属分类:基因突变检测
 

将单细胞分离以后,我们可以从中提取出DNA或是RNA。但单个细胞中遗传物质的含量是极少的,无法用于测序,必须先进行扩增。

 

全基因组扩增

        全基因组扩增技术包括连接反应介导的PCR技术、扩增前引物延伸反应技术、简并寡核苷酸引物PCR技术等,但在PCR过程中,DNA片段的大小、DNA的二级结构、GC含量等会影响聚合酶的扩增效率甚至导致酶从模板上脱离,不能完整地覆盖基因组,并且会往序列中引入很多错误和非特异性扩增产物,存在扩增偏倚。

直到多重置换扩增技术(multiple displacement amplification, MDA)横空出世,解决了这一难题。MDA技术是在恒温下利用具有强模板结合的phi29DNA聚合酶和六聚物进行链置换扩增反应。其优点是样本无需纯化,操作简单,产生的DNA片段长(10-100 kb),错误率低,有着良好的DNA扩增覆盖效果,扩增出10-100 kb大小的片段,是比较常用的技术,缺点是起始模板量低时扩增偏差性大。

        为了提高扩增的覆盖度和均匀度,相关技术也在不断发明和改进。Xie等发明了基于多次退火环状循环的扩增技术(multiple annealing and looping-based amplification cycles, MALBAC),结合MDA扩增技术和PCR扩增技术的优势,通过利用特殊设计的引物,巧妙地使扩增子的结尾通过互补而成环,进而在一定程度上防止了基因组DNA的指数性扩增,明显降低了扩增偏倚性,并显著提高覆盖度。

        下图直观地展示了从两种WGA方法获得的扩增产物的均一性差异。在MDA产物中,染色体上有多处位置获得了巨幅扩增,但也有些位置根本没有获得扩增。这样的扩增效果显然会给下游检测带来麻烦,甚至虚假的结果。而MALBAC扩增产物的均一性有了很大改进,染色体上的所有位置都得到一定程度的扩增。这样的扩增产物在下游检测,特别是在基因(或染色体)拷贝数变异(Copy Number Variation,CNV)检测中效果会好得多。

基因突变检测
转录组扩增

       转录组扩增技术类别也非常多,如Quartz-seq、Cel-seq、Single-celltagged reverse-transcription、Quantitative single-cell mRNA-seq等。应用最为广泛的还是Tang’s single-cell mRNA-seq和Smart-seq。

Tang等首次基于微阵列分析的方法实现了单细胞RNA测序,通过多聚T碱基作引物,逆转录合成第一条cDNA并延长到3 kb,并在3’末端添加多聚A碱基,以此作为合成第二条cDNA链时多聚T碱基引物的结合位点,接下来通过PCR对cDNA进行扩增。最终发现了以往芯片未能检测到的基因和可变剪切位点。但是基于芯片的技术比较封闭,不能检测分析未知的基因,不能确定mRNA的具体长度和序列,无法区分正反义链的转录本。

        SMART则是目前常用的一种mRNA全长扩增技术。该技术依然用多聚T碱基作下游引物开始逆转录,但使用的逆转录酶是SMARTscibeRT酶,会在转录的末端延长出几个超过模板的C碱基,转录出的cDNA可以用带3个G碱基的上游引物进行扩增。Sandberg等通过这项技术,研究分析了复发性恶性黑色素瘤病人的肿瘤细胞的基因表达情况,证实肿瘤细胞能够激活很多负责躲避体内监控系统的膜蛋白。随后,Sandberg研究小组改进了初始方法,提高了捕获RNA分子的数量,获得更加完整的基因序列,并命名为SMART-seq2技术。SMART-seq2利用现成的试剂,因此成本比较低。

 

 

 

 

测序过程的难点

        比起普通的测序,单细胞测序又有哪些难点呢?一是扩增幅度的均匀性难以保证,二是不完美的单细胞序列扩增给下游检测带来风险,也称为脱扣。前一种难点可以通过MALBAC来较好地解决,脱扣则较难避免。

下图直观地展示了这种风险。因为单细胞扩增的起始模板只有一个拷贝的基因组,也就是说每个位点的扩增起始模板只有两个分子(因为人是二倍体生物)。一旦在扩增过程中发生错误,后续检测就会把一个杂合位点误认作纯合位点(图.a)。反之,也会把一个纯合位点误认作杂合位点(图.b)。图c展示了几种WGA产品在进行单细胞扩增时脱扣率的对比情况。图中可见,在这几种产品中脱扣率最低的约为21%(Yikon),最高的可达76%(Sigma-Aldrich)。

         脱扣率在单细胞SNP的检测中至关重要,如果脱扣率过高,所得结果的可靠性就很低。以SNP为依据的单倍型判断的可靠性也会很低。这对肿瘤、生殖相关的检测都是很不利的。

应用进展

        由于细胞的异质性,单细胞测序技术的发展已成为必然。近年来也有许多研究成果。

      肿瘤细胞研究是单细胞测序首先应用的领域。

Xu等使用显微操作技术从肾肿瘤中分离出单个细胞,裂解后,使用MDA进行单细胞测序,发现没有明显的细胞亚群,肿瘤细胞之间的突变频率和位置也不尽相同,表明肾肿瘤更加具有异质性,需要开发更加有效的细胞靶向疗法。这样也有利于研究肿瘤的发展机制和转移机制。

基因突变检测
        单细胞测序使得通过单个细胞研究个体发育成为可能。

Xue等使用酸性溶液除去透明带,然后在无钙培养基中分离单个卵裂球。裂解细胞后,通过Tang’s single-cell mRNA seq分别对人和小鼠胚胎从卵母细胞到桑堪胚进行转录组测序分析。通过加权基因共表达网络分析,发现每个发育阶段都可以被少量由共表达基因组成的功能模块准确区分,表明从分裂到桑堪胚阶段中细胞循环、基因调控、翻译和代谢中的转录谱以一定的顺序变化着,此外也研究了人和小鼠胚胎发育过程中基因表达情况的差异。

        单细胞测序是一门较新的技术,还有很大的发展空间。尤其是植物中的单细胞分离更是一大难点。

 

 

发表评论

您必须登录才能发表评论!