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将单细胞分离以后,我们可以从中提取出DNA或是RNA。但单个细胞中遗传物质的含量是极少的,无法用于测序,必须先进行扩增。
直到多重置换扩增技术(multiple displacement amplification, MDA)横空出世,解决了这一难题。MDA技术是在恒温下利用具有强模板结合的phi29DNA聚合酶和六聚物进行链置换扩增反应。其优点是样本无需纯化,操作简单,产生的DNA片段长(10-100 kb),错误率低,有着良好的DNA扩增覆盖效果,扩增出10-100 kb大小的片段,是比较常用的技术,缺点是起始模板量低时扩增偏差性大。
Tang等首次基于微阵列分析的方法实现了单细胞RNA测序,通过多聚T碱基作引物,逆转录合成第一条cDNA并延长到3 kb,并在3’末端添加多聚A碱基,以此作为合成第二条cDNA链时多聚T碱基引物的结合位点,接下来通过PCR对cDNA进行扩增。最终发现了以往芯片未能检测到的基因和可变剪切位点。但是基于芯片的技术比较封闭,不能检测分析未知的基因,不能确定mRNA的具体长度和序列,无法区分正反义链的转录本。
下图直观地展示了这种风险。因为单细胞扩增的起始模板只有一个拷贝的基因组,也就是说每个位点的扩增起始模板只有两个分子(因为人是二倍体生物)。一旦在扩增过程中发生错误,后续检测就会把一个杂合位点误认作纯合位点(图.a)。反之,也会把一个纯合位点误认作杂合位点(图.b)。图c展示了几种WGA产品在进行单细胞扩增时脱扣率的对比情况。图中可见,在这几种产品中脱扣率最低的约为21%(Yikon),最高的可达76%(Sigma-Aldrich)。
Xu等使用显微操作技术从肾肿瘤中分离出单个细胞,裂解后,使用MDA进行单细胞测序,发现没有明显的细胞亚群,肿瘤细胞之间的突变频率和位置也不尽相同,表明肾肿瘤更加具有异质性,需要开发更加有效的细胞靶向疗法。这样也有利于研究肿瘤的发展机制和转移机制。
Xue等使用酸性溶液除去透明带,然后在无钙培养基中分离单个卵裂球。裂解细胞后,通过Tang’s single-cell mRNA seq分别对人和小鼠胚胎从卵母细胞到桑堪胚进行转录组测序分析。通过加权基因共表达网络分析,发现每个发育阶段都可以被少量由共表达基因组成的功能模块准确区分,表明从分裂到桑堪胚阶段中细胞循环、基因调控、翻译和代谢中的转录谱以一定的顺序变化着,此外也研究了人和小鼠胚胎发育过程中基因表达情况的差异。