万例ctDNA检测分析，41.2％患者可受益于靶向治疗！

癌症基因组分析已显著改变多种恶性肿瘤的临床管理。TCGA项目和MSK-IMPACT队列已经对多种癌症类型进行了全面的基因组分析，然而这些数据主要集中在白人患者中，缺乏来自亚洲患者的数据，这些患者分别占总体癌症发病率和死亡率的50%和70%。

尽管中国是世界上人口最多的国家，但仍缺乏中国癌症患者的全面基因组信息，尤其是中国的泛癌种ctDNA检测分析数据，因此，明确中国泛癌种患者的基因组图谱有助于改善治疗方案和生存率。

2021年1月4日，《Nature Communications》发表了超万例中国泛癌种患者ctDNA检测分析数据，对cfDNA中的克隆性造血变异，泛癌种的ctDNA可检测性和分子特征，泛癌种的ctDNA突变图谱，肿瘤克隆结构和治疗可操作性等方面进行了分析，有助于改善中国癌症患者的治疗方案和生存率。¹

此次分析共纳入11,525例癌症患者的13,333份血液样本，其中54.8%（7,303/13,333）来自IV期患者，11.4%（1,519/13,333）来自I-III期患者，33.8%（4,511/13,333）来自分期不详患者。分析包括41种主要癌症类型，最常见的是非小细胞肺癌（n=5,548），其它常见类型包括结直肠癌（n=1,195），乳腺癌（n=1,178），上消化道癌症（n=575）和肝细胞癌（n=571）等。

样本采集：室温下，采用streck管采集10ml外周血，72h内处理；

 

cfDNA浓度：血浆cfDNA的平均提取浓度为31.9 ng/ml（1.05–396.0 ng/ml），各癌症类型之间无明显差异；

 

检测产品：1021基因 NGS 大panel，包括12种实体瘤常见驱动基因区域，化疗、靶向及免疫相关基因区域，及COSMIC和TCGA记录的高频突变区域，大小为1.09Mb；

 

cfDNA测序：血浆cfDNA的中位测序深度为4,429X（1,000-30,368X），白细胞对照的中位测序深度为423X（369-7,279X）；

 

测序平台：华大 MGISeq-2000

② 常见克隆性造血（CH）突变基因有15个，其中最常见的是DNMT3A，TP53，TET2和PPM1D；不同癌症的CH变异发生率不同，黑色素瘤，膀胱癌，子宫癌和前列腺癌中发生CH变异>20%，肾癌和甲状腺癌中发生CH变异<10%，其他癌症中发生CH变异在10~20%之间；不同癌症的CH基因发生不同，TP53是黑色素瘤和小细胞肺癌中最常见的CH基因，而DNMT3A是子宫癌和宫颈癌中最常见的CH基因（图1a）；

③ cfDNA中克隆性造血（CH）变异的等位基因频率（AF），大多数在0~10%之间（图1b）；

④ cfDNA中克隆性造血（CH）变异的等位基因频率（AF）显著低于非CH变异的AF（P<0.001）（图1c）；

⑤ cfDNA中克隆性造血（CH）变异通常随年龄的增长而增加，40以下CH变异发生率为9.1%，80岁以上CH变异发生率为23.1%（图1d）；

⑥ 一些cfDNA中克隆性造血（CH）变异可能无法通过白细胞测序筛查出来，然而，与肿瘤来源的变体相比，这一比例将是有限的。对cfDNA，肿瘤组织和白细胞分别进行测序，然后将血浆cfDNA中检测到的变异分为三类：cfDNA和WBC同时存在的变异（WBC-matched），cfDNA和组织活检同时存在的变异（Biopsy-matched）及仅发生在cfDNA中的来源不明变异（VUSOs），显示白细胞过滤可能不太干净，提示亚克隆变异是一个可能的来源。cfDNA中来源不明变异更少分布在CH相关基因中，不过血浆cfDNA中检测的到的WBC-matched和VUSOs变异AF仍然显著低于Biopsy-matched变异AF（图1e，1f，1g）。

② ctDNA的可检测性因不同癌症类型而异，其中小细胞肺癌（91.1%），前列腺癌（87.9%），子宫癌（77.6%）、肝细胞肝癌（77.1%）和上消化道癌症（76.9%）显示出比其他癌症更高的灵敏度；甲状腺癌（41.8%）和肾癌（56.4%）的ctDNA可检测率较低（图2a）。此外，79.7% IV期样本和57.9% I-III期样本（提示可早筛）可检测到基因变异；

③ ctDNA的等位基因频率（AF）在不同癌症类型和相同癌症类型的不同样本中均存在显著差异，此外，与其他类型肿瘤相比，脑胶质瘤的ctDNA AF最低，可能是由于血脑屏障存在的缘故（图2b）；

④ bTMB是一种潜在的免疫治疗生物标志物，小细胞肺癌，子宫癌，膀胱癌，结直肠癌和宫颈癌相较于其它癌种有更高的bTMB，但在甲状腺癌和脑胶质瘤中bTMB最低（图2c）。此外，该队列与MSKCC组织TMB排名相似，但存在一些差异性，黑色素瘤和脑胶质瘤在MSKCC中tTMB较高，但在bTMB中较低，这表明ctDNA的脱落可能影响循环肿瘤负荷的测定；

⑤ 按照四分位75%来区分bTMB的高低，cut-off值为8.7 mut/Mb，超过一半的小细胞肺癌样本被认为是bTMB-H（65/114，57%），此外，非小细胞肺癌，膀胱癌、结直肠癌和宫颈癌也占较大比例的bTMB-H，表明应针对不同癌症类型分析确定bTMB的临界值（图2d，2e）；

⑥ 大多数癌症类型ctDNA检测显示出比MSKCC组织中更高的突变等位基因肿瘤异质性（MATH），这表明相较于单区域活检（可能忽略亚克隆低AF变异），使用ctDNA突变等位基因肿瘤异质性（MATH）算法量化肿瘤异质性具有潜在的优势（图2f）。

② ctDNA液体活检与组织活检检测到的驱动基因频率显示出很强的线性关系（R²=0.87），总体上是一致的，但也存在不一致的地方。本研究观察到的独特的突变发生率可能暗示了中国癌症患者的致病驱动特征，此外，样本来源，测序方法，检测灵敏度，患者性别和年龄分布等也可能导致这些差异（图3b）。

▲ 图3. 泛癌种ctDNA的突变态势

③ 通过ctDNA评估与增殖潜能相关的10种典型信号通路的特定基因，最常见的是RTK-RAS通路变异（56.1%），其次是P53通路（53.9%）和PI3K通路（22.8%）；最显著的特征是RTK-RAS通路与其他通路之间没有共存，RTK-RAS与P53/PI3K通路之间存在轻微的互斥性，这表明仅RTK-RAS通路就可以诱导肿瘤的发生，这些结果说明了不同通路之间的相互影响，揭示了功能上的相互作用和依赖关系，这些可以用于治疗（图4）。

MATH算法反映出ctDNA的高度异质性意味着其复杂的克隆结构。考虑到大多数样本来自正在接受治疗的晚期癌症患者，因此丰富的ctDNA可以重建基因组克隆性。

① 在整个血浆队列中，突变的克隆性分布几乎是双峰的，其中两个最大值通常分别下降>0.9和<0.1，不过不同癌种的主要克隆基因不同（图5a）。在克隆性≥0.9的亚组中，9种常见驱动基因（TP53、EGFR、PIK3CA、KRAS、APC、RB1、NF1、ERBB2和BRAF）的变异百分比为47.1%，但在克隆性<0.1的亚组中变异频率约为9.5%。

② TP53，EGFR，KRAS和PIK3CA在不同癌症类型中的克隆分布与既往报道一致，提示ctDNA定向克隆性分析是确定肿瘤克隆结构的有利选择（图5b）。

基于ctDNA液体活检最有意义的应用之一是寻找药物敏感的标志物，并为靶向治疗进展的患者确定耐药机制。

① 研究者分析了具有基因组变异的8,032例血浆样本，并排除了组织学未知的肺癌和未知的原发癌样本。根据OncoKB数据库建立的标准和其他证据报告，研究者从3,306例样本（41.2％）中检测出4,665个潜在的药物敏感性靶标。其中，2,299例样本（28.6％）达到了1级用药标准，100例样本（1.2％）达到了2A级用药标准，221例样本（2.8％）达到了2B级用药标准，226例样本（2.8％）达到了3A级用药标准，还有459例样本（5.7％）达到了3B级用药标准。在非小细胞肺癌，乳腺癌，上消化道癌症，胃肠道间质瘤，卵巢癌，膀胱癌，黑色素瘤和结直肠癌中均观察到1级用药物标准变异（图6a）；

② 总共检测到63种药物敏感性标志物，包括各癌种可行性通路变异靶标，最常见的是EGFR 19del（图6b）；

③ 在几种可能带有药物敏感性标志物的癌症类型中，如非小细胞肺癌，胃肠道间质瘤，乳腺癌，宫颈癌和黑色素瘤中，标记物的克隆性通常高于其他类型，表明其药物敏感克隆的细胞分数较高，提示靶向药物的潜在效率和功效（图6c）；

④ 此外，对137例按照ctDNA突变图谱进行靶向治疗的癌症患者成功完成了临床随访，其中包括114例非小细胞肺癌，17例乳腺癌和6例结直肠癌。绝大多数患者为IV期，无进展生存期（PFS）为4~1198天。血浆ctDNA的突变数和AF均与患者PFS呈中等程度的负相关（图7a）；突变数≤2的患者中位PFS为12.8个月，显著长于突变数≥2的患者（中位数为5.1个月，图 7b）；同样，AF≤0.01的患者PFS（中位数，12.8个月）显著大于AF> 0.01的患者（中位数，5.8个月）（图7c）。这些结果表明，ctDNA还可以帮助预测治疗的预后。

▲图7. ctDNA图谱测定的循环肿瘤负荷与治疗预后相关

综合可见，ctDNA提供了一种非侵入性方法来阐明癌症患者的基因组全景和可操作信息。超万例中国泛癌种患者的血浆cfDNA和白细胞平行测序显示，cfDNA中有14%会检出克隆性造血变异，其可检测性随年龄增长而增加。消除克隆性造血变异后，在73.5%的血浆样本中检测到ctDNA，其中小细胞肺癌（91.1%）和前列腺癌（87.9%）显示出最高的可检测性。ctDNA液体活检与组织活检检测到的驱动基因频率相似（R²=0.87），但也显示出一些差异，例如非小细胞肺癌中较高的EGFR突变频率（44.8％ vs 25.2％）和较低的KRAS突变频率（6.8％ vs 27.2％），在肝细胞肝癌中较高的TP53突变频率（53.1％ vs 28.6％）。高达41.2%的血浆ctDNA样本检测到药物敏感性基因变异，预示着41.2%的癌症患者可从靶向治疗中获益。这些所有的发现可能有助于确定治疗靶点和联合治疗的策略。

参考资料：

1.Zhang Yongliang,Yao Yu,Xu Yaping et al. Pan-cancer circulating tumor DNA detection in over 10,000 Chinese patients.[J] .Nat Commun, 2021, 12: 11.